黄柏 苍术成分、功效与作用、临床应用 - 中药对药化学

34.黄柏 苍术 : 【中医理论】
黄柏(炒),苍术(米泔浸,炒)各等分,每服6g,为末,沸汤,入姜汁调服。称二妙散,用于湿热下注证的筋骨疼痛,两足痿软,或湿热带下,下部湿疮等。取黄柏寒以胜热,苦以燥湿,且善祛下焦之湿热。以苍术燥湿健脾,使湿邪去而不再生。两药相合,清流洁源,标本兼顾,使湿热得除,诸证自解。
二妙散原为散剂(现在多用丸剂或汤剂),细考典籍,本方原名应为苍术散。最早见于元·至正5年(1345年)危亦林所著《世医得效方》卷九的“脚气”门中,其后明·成化17年(1481年)复刊元·朱震享《丹溪心法》首将由黄柏、苍术组成的苍术散另称为二妙散。由于朱震亨声名显赫,复因二妙散的方名较苍术散更易于记诵,故朱氏的二妙散遂成为医林皆晓的清热燥湿名方,而危氏所创苍术散却鲜为人知。清·道元19年(1839年),林佩琴所著《类证治裁》又将二妙散改作丸剂,称为二妙丸^[1]。
【化学研究】
1.样品制备
苍术(炒)500g,黄柏(炒)500g。以上二味,粉碎成细粉,过筛,混匀,用水泛丸,干燥,即得[2]。
2.显微鉴别
取本品,置显微镜下观察:草酸钙针晶细小,长5～32μm,不规则地充塞于薄壁细胞中。黄色纤维大多成束,周围细胞含草酸钙方晶,形成晶纤维,含晶细胞壁木化,增厚,可见黄色不规则分枝状石细胞[2]。
3.化学鉴别
取本品粉末2g,置具塞试管中,加乙醚10ml,振摇10min,分取上清液2ml置具塞试管中,加高锰酸钾试液2滴,振摇1min,红色即消失[2]。
4.薄层鉴别
4.1 黄柏及盐酸小檗碱的色谱鉴别
方法1:取本品0.1g,研碎,加甲醇5ml,置水浴上加热回流15min,滤过,滤液补加甲醇使成5ml,作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述三种溶液各1μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(12:6:3:3:1)为展开剂,置氨蒸气预饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点;在与对照品色谱中相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点[2]。
方法2:取本品粉末2g,加乙醇10ml,置水浴上回流10～30min,取上清液,作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液5μl,对照品溶液10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-醋酸-水(7:1:2)为展开剂,开展,取出,晾干。供试品色谱中,在与对照照品色谱相应的位置上,显相同的一个黄色斑点[3]。
方法3:取本品1g,研碎,置索氏提取器中,加乙醇回流提取至无色,提取液蒸干,加乙醇25ml使溶解,作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品和盐酸掌叶防己碱对照品,分别加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液2μl,对照品溶液各4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-二乙胺(8:2:2:1:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯365(nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点[3]。
方法4:取本品,在80℃干燥2h,研细,取3g,置索氏提取器中,加乙醚25ml,回流提取1h,弃去乙醚液,取出滤纸筒,挥尽乙醚,再置索氏提取器中,加甲醇提取至近无色,提取液回收甲醇至干,加甲醇5ml使溶解,作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液1μl,对照品溶液3μl,分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以正丁醇-醋酸-水(7:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点[3]。
4.2 苍术的色谱鉴别
取本品2g,研碎,加乙醚15ml,置具塞烧瓶中,超声处理15min,滤过,滤液低温挥去乙醚,残渣加醋酸乙酯1ml使溶解,作为供试品溶液。另取苍术对照药材0.25g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液4～6μl,分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H板上,以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(10:1)为第一展开剂,展开4cm,取出,晾干,再以环己烷为第二展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,80℃加热数分钟,至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点[3]。
5.含量测定
5.1 二妙丸中盐酸小檗碱的定量
薄层扫描法:取本品适量,研细,取约1g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚适量,加热回流1～2h,弃去乙醚液,残渣挥去乙醚,加甲醇适量,回流提取至提取液无色,将提取液(必要时适当浓缩)转移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.06mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,精密吸取供试品溶液1μl、对照品溶液1μl和3μl,分别交叉点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(12:6:3:3:1)为展开剂,置用氨蒸气与展开剂同时预饱和15min的双槽展开缸内,展开,取出,晾干,照薄层色谱法(附录ⅥB薄层扫描法)进行荧光扫描,激发波长λ=365nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值,计算,即得。
本品按干燥品计算,每1g含黄柏以盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCl)计,不得少于3.0mg[2]。
5.2 二妙丸中掌叶防己碱的定量
薄层扫描法:制备标准品液及样品液。薄层层析条件:预制硅胶G板120℃活化2h,吸取盐酸小檗碱和盐酸掌叶防己碱标准品液各20μl以及二妙丸样品液20μl,点样于同一块薄层板上。以醋酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-二乙胺(8:2:2:1:0.5,需新鲜配制)上行法直线展开约12cm,挥干溶剂后,在紫外光灯(365nm)下观察。小檗碱和掌叶防己碱斑点均呈亮黄色,Rf值分别为0.30和0.20;薄层扫描条件:扫描方式:反射锯齿法。波长选择:对以上硅胶G薄层板上的标准品液和样品液斑点的吸收光谱保持一致。确定以最大吸收波长345nm为样品波长(λS),最小吸收波长305nm为参比波长(λR),进行扫描测定。峰检出方式:面积法(狭缝宽×高)0.4mm×0.4mm,散射系数:SX=3,背景校正:“ON”,线性试验得回归方程分别为:小檗碱:A=4514W+793,掌叶防己碱:A=1308W-241,通过计算得到A和W相关系数分别为:盐酸小檗碱0.9999,盐酸掌叶防己碱0.9995,故二者在0.2～1.07μg(小檗碱)和0.1～0.5μg(掌叶防己碱)之间线性关系良好。
5.3 二妙丸中药根碱及小檗碱〔4〕掌叶防己碱的定量
高效液相色谱法:色谱条件的选择:固定相:Nova-Pak C18,44cm,3.9mm×15mm(Waters公司);流动相:乙腈-水(1:1000ml含磷酸二氢钾3.4g及十二烷基硫酸钠1.7g);检测波长:345nm;柱温:室温;流量:0.9ml/min;理论塔板数按小檗碱、掌叶防己碱和药根碱计算不得低于9000、7500和6000,此条件下3种对照品与其他组分达到基线分离。
标准曲线的准备:精密称取小檗碱、掌叶防己碱和药根碱对照品各约11.28mg、10.45mg和11.07mg,用甲醇定容至100ml,作为储备液。分别量取上述溶液1ml,定容至25ml,作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、5、6、10、18、30、40和60μl进样,按上述色谱条件测定峰面积,分别以小檗碱、掌叶防己碱和药根碱进样量X(μg)为横坐标、峰面积值Y为纵坐标进行回归计算,结果小檗碱回归方程Y=-167+166539X,r=0.9988;掌叶防己碱回归方程Y=1350+1868557X,r=0.9992;药根碱回归方程Y=1067+1943950X,r=0.9993。
进样重现性和稳定性考察:精密吸取上述对照品溶液5μl,分别于0、15、30、60、180和1440 min重复进样6次,结果表明:小檗碱、掌叶防己碱和药根碱其RSD(%)分别为1.28、1.11和1.19。
样品提取率的考察:小檗碱、掌叶防己碱、药根碱易溶于水、甲醇等溶剂,我们采用甲醇作为提取溶媒,超声波处理,结果表明:处理3次后3种生物碱均可完全提尽。
样品测定方法拟定:取黄柏药材照品、二妙丸、三妙丸适量,精密称重,置10ml具塞离心管内,加5 ml甲醇超声提取15 min,离心(3 000 r/min)5 min,倾取上清液,过滤。重复操作3次,合并滤液,滤纸及残渣用甲醇清洗,过滤,并入上液,定容至25 ml;用微孔滤膜过滤,弃去初滤液约3 ml,取续滤液5 ml备用。
干扰因素考察:取二妙丸、三妙丸,阴性对照品,按照样品测定方法的条件进行试验,发现在小檗碱、掌叶防己碱和药根碱处,色谱中无干扰峰出现。
加样回收率试验:取已知含量的二妙丸7份,精密称定,其中6份加入小檗碱、掌叶防己碱和药根碱对照品储备液各2、1、0.2 ml,1份不加。用上述操作条件提取、测定,计算加样回收率:小檗碱、掌叶防己碱和药根碱的加样回收率(%)分别为98.67±2.38、98.75±1.67和98.38±2.31。
样品中小檗碱、掌叶防己碱和药根碱的定性和定量分析:精密吸取供试品溶液,注入HPLC仪中,按上述色谱条件测定峰面积,用标准曲线法计算样品中小檗碱[(C20H17NO4)Cl·2H2O]、掌叶防己碱[(C20H18NO4)Cl·2H2O]和药根碱[(C20H18NO4)Cl]的含量。样品测定结果见表2-34-1[5]。

2-34-1 样品中3种成分的含量测定结果

　 小檗碱 掌叶防己碱 药根碱 二妙丸 0.285
0.088
0.112
0.105
0.107
0.167
0.123
0.133
0.069
0.061
0.082 0.107
0.065
0.077
0.066
0.064
0.100
0.079
0.079
0.046
0.042
0.057 0.003
0.005
0.004
0.013
0.006
0.005
微量
0.005
0.006
微量
0.007 三妙丸 0.060
0.018
0.015
0.047
0.084
0.072
0.066
0.057
0.072 0.039
0.010
0.009
0.029
0.057
0.048
0.053
0.034
0.052 微量
微量
微量
0.003
0.003
0.006
0.003
0.002
0.004

续表

小檗碱 掌叶防己碱 药根碱 0.033 0.020 微量 0.170 0.079 0.002 0.058 0.046 0.002 0.073 0.046 0.002 0.074 0.052 0.005 0.062 0.036 0.004

5.4二妙丸中5种生物碱的定量分析(反相高效液相色谱法)[6]
液相色谱条件:色谱柱为Nucleosil-ODS5mm×250mm分析柱。流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液-十二烷基硫酸钠(60ml:40ml:0.1g);流速为1.0ml/min;检测波长:264nm;柱温:25℃。
标准曲线制备:精密称取盐酸小檗碱1.97 mg、盐酸巴马汀1.66 mg,黄柏碱2.22 mg,HB-1 5.00 mg置25 ml容量瓶中,另精密称取盐酸药根碱1.65 mg置5 ml容量瓶中,加甲醇溶解稀释至刻度后,吸取1 ml置上述25 ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制得混标溶液。取上述5种生物碱混合液进样,用峰面积y对进样量x(μg)回归,得各标准品的回归方程见表2-34-2。

2-34-2 各种生物碱标准的回归方程

生物碱 回归方程 r 盐酸小檗碱 y=0.0568+1.6077x 0.9976 巴马汀 y=-0.0239+1.5392x 0.9991 药根碱 y=0.0108+1.4824x 0.9986 黄柏碱 y=0.006+0.1912 0.9989 HB-1 y=0.0068+0.6263x 0.9980

提取方法对生物碱含量的影响:提取次数对生物碱含量的影响:取相同比例的黄柏和苍术生药粉末,分别精密称定后混合,首次加甲醇10 ml超声0.5 h,以后均加甲醇5 ml超声15 min,离心过滤,合并滤液,真空浓缩至干,用甲醇定量转移至5 ml容量瓶中,稀释至刻度。1～5次提取各生物碱的含量见表2-34-3。结果表明,提取5次时生物碱的含量最高。

表2-34-3 提取次数对生物碱含量的影响

提取次数 生物碱的含量 总量 小檗碱 巴马汀 药根碱 黄柏碱 HB-1 1
2
3
4
5 0.179
0.395
0.547
0.664
0.706 0.119
0.263
0.365
0.442
0.471 0.0056
0.0071
0.0084
0.0094
0.0114 0.0175
0.0466
0.0658
0.0789
0.0843 0.091
0.151
0.196
0.249
0.294 0.412
0.862
1.182
1.143
1.467

超声提取与回流提取所得生物碱含量的比较:取上述精密称定后混合的药材粉末,同上法超声提取5次;别取样品,装入滤纸筒,置索氏提取器中,用甲醇回流提取至无色(约需12h),回收甲醇,定量转移至5ml容量瓶中,稀释至刻度,结果见表2-34-4。甲醇回流提取的生物碱含量较超声提取五次的含量为高。以下均采用甲醇回流提取的方法提取样品。

表2-34-4 超声提取与回流提取对生物碱含量的影响

提取方法 生物碱含量(%) 总量 小檗碱 巴马汀 药根碱 黄柏碱 HB-1 超声提取
回流提取 0.638
0.936 0.425
0.0247 0.0108
0.0877 0.0861
0.304 0.288
1.975 1.448

加样回收率:取上述精密称定后混合的生药粉末,装入滤纸筒内,同时定量的加入不同量的HB-1标准溶液,或加入一定的盐酸小檗碱和盐酸巴马汀标准溶液,分别置索氏提取器中,用甲醇回流提取12h,回收甲醇,定容于5ml容量瓶。测定回收率,结果见表2-34-5。

表2-34-5 HB-1、小檗碱和巴马汀的加样回收率

样品 加入量(mg) 测定量(mg) 回收率(%)(%) RSD(%) HB—1 0.203
0.158
0.126
0.090
0.045 0.204
0.163
0.119
0.087
0.046 100.49
103.16
94.44
96.67
102.22 99.40 3.74 小檗碱
巴马汀 0.271
0.182 0.269
0.179 99.12(n=12)
98.35(n=5) 3.42
3.15

精密度试验:取甲醇回流法提取的样品溶液一份,连续测定5次,RSD分别为小檗碱0.65%;巴马汀0.72%;药根碱0.32%;黄柏碱0.28%;HB-10.47%。
样品的测定:取甲醇的回流法提取的样品溶液5份,按上述色谱条件测定,外标两点法计算,结果见表2-34-6。

表2-34-6 二妙散中5种生物碱的含量(n=5)

　 小檗碱 巴马汀 药根碱 黄柏碱 HB—1 总量 含量,% 0.914 0.609 0.0247 0.0839 0.313 1.945 RSD,% 4.73 4.93 2.48 2.69 4.65

5.5 季铵盐的定量分析(直接电位法)[7]
刘万忠等利用小檗碱场效应传感器测定黄柏及其制剂中季铵盐的方法,几乎所有共存的物质均不干扰测定。样品只需用水提取,方法简便、快速、准确。
传感器的制备:取1mg/ml小檗碱溶液25ml,在搅拌下慢慢滴加10-2mol/L硅钨酸溶液50ml。沉淀放置1 h后,抽滤,水洗5次,减压干燥,得活性物质。取该活性物质约5 mg,加5%聚氯乙烯四氢呋喃溶液5 ml及邻苯二甲酸二丁酯0.6 g,搅拌,使成透明溶液,即可制成小檗碱传感器。
传感器的性能:经测试,该传感器在水溶液中对小檗碱的线性响应范围1～1000μg/ml,斜率57mV/pc,检测下限0.8μg/ml,适宜pH范围为3～10。在100μg/ml,小檗碱溶液中,响应时间小于10 s,4 h电位变化的标准偏差小于0.4 mV。固定干扰法测定了共存物质的电位选择系数。颅痛定、黄连碱、巴马汀和药根碱的测定结果分别为5.6×10-2,1.0,5.1×10-1和1.0×10-1。即与小檗碱结构类似的季铵盐对小檗碱的测定的干扰。当这几种季铵盐共存时,该方法只能测定其中季铵盐的总量(以盐酸小檗碱计)。
底液的选择及回归方程的测定:分别在0.1 mol/L NaH2PO4和0.1 mol/L Na2HPO4介质中测定了传感器对小檗碱的响应和黄柏中小檗碱的含量。结果表明,在第二种介质中传感器的灵敏度较高(约58mV/mv/pc),但稳定性稍差。实验选择第一种介质作底液,电位对浓度对数的回归方程:E=285.3+52.1 lgC,相关系数r=0.9991在两种介质中测得黄柏含量分别为0.701%和0.683%,两结果比较接近。
提取方法的选择:采用3种不同的提取方法测定了2批黄柏、2批二妙丸和三妙丸中季铵盐的含量(以盐酸小檗碱计)。A.样品粉末直接加水加热煮沸提取1 h; B.样品粉末加乙醇回流提取2 h; C.样品用0.1% HCl甲醇溶液索氏提取4 h。
结果如表2-34-7所示。实验选用水提取,较为简便、经济,结果同索氏提取法相接近。

表2-34-7 不同提取方法的结果比较(%)

样品 A法 B法 C法 1
2
3
4
5
6 0.701
0.725
0.310
0.292
0.184
0.170 0.689
0.713
0.305
0.287
0.182
0.158 0.711
0.723
0.316
0.901
0.186
0.176

回收率试验:取苍术和牛膝细粉适量加入不同量的小檗碱标准品,按照样品分析方法,测定其中小檗碱含量,计算回收率,如表2-34-8所示。其平均回收率为99.1%,相对标准偏差为1.2%。

表2-34-8 加样回收试验结果

样品 已知量(mg) 加入量(mg) 测出量(mg) 回收量(mg) 回收率(%) 0.5g黄柏 3.53 4.98 8.55 5.02 100.8 0.5g苍术 0 4.98 4.89 4.89 98.2 0.5g牛膝 0 4.98 4.95 4.95 99.4 0.5g黄柏+0.5g苍术 3.53 4.98 8.40 4.87 97.8 0.5 g黄柏+0.5g牛膝 3.53 4.98 8.51 4.98 100.0 0.5g黄柏+0.5g苍
术+0.5g牛膝 3.53 4.98 8.42 4.89 98.2

样品分析:取样品粉末适量(约相当于黄柏0.5 g),精密称定,加水80 ml加热回流提取1 h,冷却,移至100ml量瓶中,加1mol/L NaH2PO4溶液10.0ml,加水稀释至刻度,测定其响应电位。标准溶液的回归方程:E=285.3±+521.lgC,计算即得样品中季铵盐的含量(以盐酸小檗碱计)同时参照文献,采用流动注射分析法测定其含量。结果一致,见表2-34-9。

表2-34-9 直流电位法和流动注射分析法对季铵盐含量的影响

品种 编号 本法 文献法 黄柏 1
2 0.701
0.725 0.710
0.720 二妙丸 3
4 0.310
0.292 0.298
0.295 三妙丸 5
6 0.184
0.170 0.181
0.175

5.6 β-桉叶醇和茅术醇的定量分析(毛细管GC法)[8]
仪器及测试条件:HP-5809A气相色谱仪;HP-7熔融石英毛细管柱,0.53mm(i.d.)×10m,填装50%聚甲基苯基硅氧烷键合相;载气:N2,20ml/min 2.5psi);进样口温度200℃;柱温:以5℃/min线性升温速度从初温80℃(保持1min)升至终20℃(保持1min);FID检测器250℃,H230ml/min,ir400ml/min;HP-3392A积分仪;进样量:1μl。himadzu Libror AEL-4OSM精密(十万分之一)天平。ZQ-2型振荡器。
内标物的选择和相对校正因子的计算:经过对辛醇、苯甲醇、樟脑、萘、桂皮醛、联苯、丹皮酚、正十八碳烷和蒽等9种对照品的筛选,确定选用丹皮酚为内标物。
对照品溶液的配制:精密称取β-桉叶醇和茅术醇各32.6mg和15.4mg,用氯仿溶解并定容至10ml,作为对照品溶液。
内标物溶液的配制:精密称取丹皮酚20.4mg,用氯仿溶解并定容至10ml,作为内标物溶液。
绝对校正因子的测定:精密量取β-桉叶醇和茅术醇对照品溶液各0.3ml和内标物溶液0.5ml,混匀,定容成5ml;吸取上述溶液1μl,注入GC仪,按上述色谱条件测定,计算,即得。
相对校正因子的确立:根据公式f=fi/fs(其中f为β-桉叶醇和茅术醇相对校正因子;fi为样品绝对校正因子,fs为内标物丹皮酚绝对校正因子)进行计算,得:fβ-桉叶醇=2.556;f茅术醇=1.620。
工作曲线的绘制:取内标物溶液等比稀释成5种浓度,进样,称定,计算,得丹皮酚的线性范围在0.052～2.04ml之间。
加样回收率试验:取已知含量的二妙丸样品,精密称定,加入β-桉叶醇和茅术醇对照品溶液适量,用上述操作条件提醇测定,内标法计算,得加样回收率分别为94.38%,95.71%,RSD(%)为4.76和4.91(n=5)。
取二妙丸、三妙丸,研细,精密称取1g,置10ml具塞离心管内,加5ml氯仿振摇1min,使均匀,在室温下浸渍24h,滤过,弃去初滤液,取续滤液1ml,加入内标物溶液0.2ml并定容成1ml,精密吸取1μl,注入GC仪,按上述色谱条件测定,内标法计算样品中β-桉叶醇和茅术醇的含量,结果见表2-34-10。
干扰因素的考察:取二妙丸、三妙丸、四妙丸,不加内标物,按照样品测定方法的条件进行试验,发现在丹皮酚内标物出峰处,色谱中无干扰峰出现。
不同品种、炮制方法药材(苍术)的测定:精密称取苍术0.5g,按照样品测定方法测定,结果见表2-34-11。
表2-34-10 样品中β-桉叶醇和茅术醇的定量分析

品名 样号 含量(%) β-桉叶醇 茅术醇 二妙丸 1 0.77 0.33 2 0.57 0.08 3 0.55 0.05 4 2.95 1.39 5 2.67 1.28 6 0.01　 7 0.01　 8 1.27 0.36 9 0.06 0.01 10 0.34 0.06 11 0.29 0.05

表2-34-11 不同品种、炮制方法苍术中β-桉叶醇和茅术醇的含量

品种 炮制方法 含量(%) β-桉叶醇 茅术醇 茅苍术 生品
炒黄
炒焦 6.52
3.05
1.16 1.47
1.91
0.29 北苍术 生品
炒黄
炒焦 2.25
0.69
0.23 0.18
0.21
0.06

另外,采用薄层比色法以无水乙醇提取二妙丸、三妙丸中的小檗碱,然后用正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)展开,刮取小檗碱斑点进行比色测定,以标准曲线求得小檗碱含量[9]。王氏等[10]则测定了二妙丸中盐酸小檗碱在人工胃液和人工肠液中的溶出度。
【药理研究】
1.对植皮小鼠细胞免疫功能的影响[11]
将BALB/C小鼠随机分为生理盐水(NS)对照组,二妙散(EMS)组,黄柏(CP)组,苍术(RA)组和抗小鼠胸腺细胞血清(ATS)对照组共5组,每组5～13只小鼠。
于植皮开始前3 dNS对照组给生理盐水,各中药组分别给100%中药煎剂,每只每天1 ml灌胃,连续21 d,ATS组于植皮前3 d及植皮时,每只动物腹腔内注入0.5 ml ATS,以后每隔7d重复1次。于植皮后7d取尾静脉血测定T细胞值,植皮后18 d取脾测定脾细胞指数。结果见表3-34-12。
T细胞值=白细胞总数×淋巴细胞百分率×酸性非特异性酯酶阳性细胞百分率(个细胞/mm3)。
CI代表小鼠脾细胞中Thy1+T细胞的百分率。

表2-34-12 二妙散对植皮小鼠T细胞值和脾细胞细胞毒指数的影响(±s)

组别 T细胞值 脾细胞细胞毒指数 生理盐水对照组 3870.03±1432.77(n=12) 81.80±1.00(n=7) 血清对照组 693.70±502.14△(n=6) 6.90±1.00△(n=3) 二妙散组 2100.28±799.95*(n=6) 28.20±6.00△(n=4) 黄柏组 2129.28±937.30*(=6) 64.40±9.00*(n=6) 苍术组 3495.16±935.97△△(n=7) 63.80±17.20△(n=7)

与生理盐水对照组比较9:*P<0.05,*P<0.01,△P<0.001,△△P>0.05,compared with NS group:NS=normal saline。
由上表可知ATS,二妙散和黄柏均可明显地降低植皮小鼠外周血中的T细胞值,与NS对照组比P<0.01或P<0.001,而苍术仅能轻度降低T细胞值。从植皮小鼠的CI看,4个药物组均有降低CI的作用。与NS对照组比差异显著,其作用强度顺序为ATS>二妙散>黄柏>苍术。
在清醒状态下固定BALB/C小鼠(受鼠),将雌性C57BL/6小鼠尾皮片(0.6cm×0.8cm)粘贴到受鼠腹部作皮片移植,观察皮片生长情况,以50%皮片坏死时间(d)(median survival time,MST)一半数生存期为排异反应开始,移植物存活时间以其±s表示。结果见表2-34-13。

表2-34-13 二妙散植皮小鼠皮片半数生存期的影响

组别 n Median survival time(d) 生理盐水对照组 13 8.39±1.76 血清对照组 6 14.50±3.99* 二妙散组 7 12.71±3.25* 黄柏组 6 12.33±1.97△ 苍术组 7 11.43±2.82△

与生理盐水对照组比:△P<0.05,*P<0.01
结果可见各组均有延长植皮小鼠皮片的MST的作用,与NS对照组相比差异非常显著。
以上这些改变都一致地说明了二妙散可能是通过抑制细胞免疫功能,使同种异体移植的排异反应得到一定程度的抑制。众所周知,移植抗原均为TD抗原。这些抗原使TH细胞活化后才能使Tc前体细胞分化成熟为更多的Tc细胞,Tc乃在皮肤移植反应中发挥杀伤移植物的作用。因此,二妙散使植皮小鼠血内T细胞总数减少,也包括了TH细胞和Tc细胞同时减少;而脾中Thy1+T细胞减少可能是二妙散使移植抗原作用下T细胞分化和增殖减弱,进入脾内和外周血的T细胞分化和增殖减弱,进入脾内和外周血的T细胞相应减少,最终导致皮肤移植排斥现象推迟发生。
黄柏和苍术二者等量配方,分别用5、3和3倍量水共煎煮3次,过滤并浓缩至干,得二妙散水煎剂提取物粉末,收率为30%,黄柏和苍术单独煎煮时的收率分别为19%和43%,实验中的剂量均按这些粉末计算。
2.对小鼠接触性皮炎(PC-DTH)诱导相的影响[12]
剃去小鼠腹毛,涂1%2、4、6-三硝基氯苯(PC)的乙醇溶液0.1ml致敏,6d后涂1%PC的橄榄油溶液30μl于右耳两面攻击,20h后测左右耳厚度,以其厚度差作为DTH的强度。自PC致敏日起连续6d经口给药。与对照组相比,黄柏100mg/kg水提取物(下同)和200mg/kg,二妙散100mg/kg对PC-DHT有抑制趋势,苍术无影响。二妙散200mg/kg和400mg/kg抑制作用显著,分别与苍术100mg/kg和200mg/kg相比有显著意义,与黄柏相比也有明显的增强趋势,氢化泼尼松也显著地抑制了该DTH。
3.对PC-DTH效应相的影响[12]
用PC致敏,6d后攻击,0.5及10h后连续3次经口给予二妙散100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg,结果显示,各剂量组均显著地抑制了PC-DTH,抑制率分别为35.7%、49%和50%。攻击0或5h后一次给予400mg/kg也显著抑制了DTH,抑制率分别为52.9%和47.8%;但10或15h后给药无则抑制作用。
4.对二甲苯及鸡蛋清所致炎症反应的影响[12]
在小鼠右耳涂30μl二甲苯致炎,2h后测两耳厚度,将其差作为炎症反应的强度。或在小鼠两后足跖皮下各注射10%新鲜蛋清的生理盐水溶液50μl致炎。1h后测两足跖厚度,将致炎前后的平均值之差作为炎症的强度。
二妙散200mg/kg和400mg/kg在二甲苯致炎前4h和2h及致炎同时连续3次,或在蛋清致炎前连续5d(末次给药后立即致炎)经口给药,对两炎症反应均无影响。
上述结果表明,二妙散对PC-DTH的诱导相和效应相均有显著的抑制作用。对前者二妙散与苍术与黄柏相比有明显的增强或增强趋势,说明二者配伍有协同作用,提示其配方的科学性和合理性。对后者的抑制作用在攻击后0及5h给药有效,10h以后给药则无效,说明二妙散仅对效应相的前期,即致敏T细胞释放淋巴因子的过程有效,而对此后的炎症过程无影响。对二甲苯及蛋清所致炎症无抑制作用支持了这一推断。因此,二妙散以PC-DTH的抑制作用可能包括抑制效应T细胞的形成及其释放淋巴因子。
陈婷等对二妙散的免疫抑制的活性成分也进行了分析研究[13]。
【毒理研究】
急性毒性:二妙散水提液小鼠口服LD50为47.04±2.08g/kg[14]。
【临床应用】
1.治疗生殖泌尿系统疾病
用本方如茯苓、泽泻、车前子为基本方,治疗小儿急性肾小球肾炎135例。风热加银花、连翘;风寒加防风、羌活;咽红肿痛加牛子、薄荷、桔梗;湿重加重苍术;热重加黄柏;血尿加水蓟炭、蒲黄炭、白茅根;蛋白尿加黄芪、内金、麦芽、六曲。结果125例全部治愈。最多服药52剂,最少服药8剂。另外,有用本方加味治疗急性肾小球肾炎、尿道膀胱炎[15],急性肾盂肾炎[16]获效。
用本方加大青叶,水煎熏洗会阴处,治疗产后会阴切口感染32例,3d内全部治愈。32例均系初产妇,平均年龄22.1岁,全部病例均作会阴左侧切开,其中顺产21例,胎头吸收术4例,产钳术6例,臀位助产术1例。17例病人有产前阴道检查史,最多达5次,产时羊水清者16例,羊水黄绿者14例,胎类状羊水2例。产后3～4d会阴切口拆线后,切口裂开,红肿有脓液,方药:苍术30g,黄柏9g,大青叶30g。每日1剂,煎2000ml,薰洗会阴部,每日2次,全部病人均作会阴切口扩创术。结果:1d见效者20例,占62.5%,2 d见效者10例,占31.25%,3 d见效者2例,占6.25%[17]。
2.在皮肤科的应用
2.1 治疗神经性皮炎、湿疹
蔡氏等用二妙散加味外用结合西药治疗慢性湿疹及神经性皮炎65例,慢性湿疹50例,余15例为神经性皮炎,均系门诊治疗;年龄1～65岁,男性47例,女性18例,分布四肢者32例,周身躯干及面颈部者23例,阴囊者10例。患病均有疼痛、瘙痒,病程3个月至6年。本组病患均经抗过敏、消炎、热敷及外涂药膏方法治疗,效果不明显。治疗方法:黄柏、苍术各15g,马齿苋20g,皂角刺、川椒、白蒺莉各9g,加水1500ml煎约300ml后过滤,用其药汁温洗涤,反复多次,待皮肤凉干后,再将地塞米松10mg、氯霉素2mg,乙醇100ml的混合液擦患部,隔日一次,直至痊愈为止。治疗结果:65例均治愈,治疗时间短者3d,长者14d,平均约7d[18]。于氏治疗湿疹患者68例,痊愈率为47.06%,好转率为33.8%,有效率为80.88%[19],张氏用本方加味治疗肛门湿疹78例,效好[20]。
2.2 治疗尖锐湿疣
赵氏用本方加土槿皮、白鲜皮、紫草、鸦胆子、生马钱子等,研粉调膏外敷,治疗尖锐湿疣10例,病程0.4～4年。经连续7d治疗,治愈9例,好转1例。随访1年,均未见复发[21]。
2.3 治疗足癣
本方加苦参、明矾、紫草、徐长卿,水煎,取药液熏洗患足,每次熏后浸泡20～30min,早晚各1次,疗效满意〔22〕。
2.4 治疗其他皮肤疾患
何氏[23]用本方合五味消毒饮,治疗脓疱疮30例,疗效显著。赵氏[24]治绣球风1例,症见阴囊皮肤瘙痒难忍且增厚,用苍术、黄柏各10g,6剂缓解,改为各15g,再6剂而愈,随访两年未复发。柏氏[25]用本方加大枫子、苦参、百部、花椒,水煎外洗配合硫黄软膏外涂,治疗疥疮,2～3d为2疗程,一般1～2疗程即可治愈。
3.治疗强直性脊柱炎
用本方治疗湿热型强直性脊柱炎。方药:苍术、黄柏、桑寄生、甘草、秦艽、防己、狗脊、石楠藤、徐长卿。配合用非甾体类抗炎药,外加针灸、按摩等。结果疗效较单纯西药配合针灸、推拿治疗组为佳[26]。
4.其他
对细菌性痢疾,急性传染性黄疸型肝炎各1例,本方加味治疗均有效[27],治疗口腔溃疡患者8例,取效满意,均痊愈[28]。
苏氏[29]用本方合身痛逐瘀汤治疗血栓性浅静脉炎、坐骨神经痛、腰椎骨质增生、男性结扎后遗症,王氏[30]治疗下肢流注,李氏[16]治疗风湿性肌炎、周期麻痹、急性传染性黄疸肝炎、菌痢,赵氏[31]、刘氏[32]治疗痿证、胃痛,胡氏[33]治疗湿热带下型不孕症等,均有一定疗效。
另有报道用二妙散可用于治疗肺结核咯血[34～35]、癫证[36]、风湿性关节炎[37]、痛风性关节炎[38]、痛风急性发作[44]、膝关节创伤性滑膜炎[39]、血栓性静脉炎[40]、热痹[41]、结节性红斑[45]、皮肤坏死后感染创面[42]、骨疽[43]等疾病[44]。